三维显微镜光学成像是利用光学层析技术获取样品三维图像的光学显微成像方法。实现三维光学成像的3D显微镜必须具有区分成像焦面的有用信号与焦面外的背景信号的能力，即光学层析能力。
通过移除焦面外的信号，显微镜可以获取厚样品中一系列的薄层信号。基于这些二维的图像，计算机技术可以重构出反映样品信息的三维图像。获取层析能力主要有两种方式：一种方式是在照明的过程中不产生焦面外的背景信号；另一种方式是在探测前或探测后移除焦面外的信号。
基于这两种方式，科学家们发展出了不同的光学显微成像方法。根据光学层析机理的不同，这些方法主要有激光共聚焦显微成像、非线性光学显微成像、结构光照明显微成像与光片照明显微成像。
